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数字PCR实验技巧攻略

发布时间:2021-09-22

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  数字PCR(DigitalPCR)技术作为新一代核酸检测和绝对定量技术,目前在痕量核酸样本检测、复杂样本稀有突变检测和微小表达差异鉴定等方面表现出的优势已被普遍认可。NGS和CRISPR等分子生物学技术的发展,为数字PCR技术在microRNA研究、基因组拷贝数精准鉴定、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定及基因细胞治疗等诸多领域带来了新的契机。基于这一功能强大的新技术,如何获得更理想的实验结果呢?下面且听小Q娓娓道来。
  引物优化设计
  良好的引物探针设计是数字PCR实验获得成功的关键因素之一。这正是众多研究人员选择LNA(锁核酸技术)的原因——LNA修饰的引物和探针采用了成熟可靠的算法设计,获得了科学家的信赖。
  使用不合适的引物可能会引入引物二聚体、非特异性扩增等,进而影响实验结果的准确性。在此,小Q建议您在设计引物时需做以下几个方面的检查,最后需对设计好的引物进行BLAST比对分析,以确保引物的特异性!
  在数字PCR绝对定量实验中,对于基因突变检测、基因表达差异分析和拷贝数变异鉴定等对实验精准性要求较高的实验,需要特异性更高的Assay。QIAGEN基于QIAcuity数字PCR平台开发并验证了针对上述常见应用的700多组dPCRLNAAssay,所有Assay均经过锁核酸修饰来增强其对互补序列的亲和力和特异性,进而提高实验结果的准确性。
  锁核酸技术优势
  样品制备
  值得注意的是,在gDNA长度≥20kb或进行拷贝数变异检测实验时,必须对样品进行酶切处理,确保大片段DNA序列或串联序列在酶切处理后,模板随机且均匀的进入独立反应体系,以实现准确和精确的定量。
  建议酶切位点
  数字PCR实验离不开包含有Mg2+、dNTP、Buffer和DNA聚合酶等PCR反应所需要的MasterMix。随着实验的不断深入,对于实验条件的要求也不断提高,其中DNA聚合酶对实验的准确性起着至关重要的作用。由于非热启动的DNA聚合酶在反应体系易使引物在室温条件下发生非特异性扩增,直接影响实验结果。为确保实验顺利进行,QIAcuityEGPCRKit和ProbePCRKit均采用抗体修饰的热启动DNA聚合酶,利用小分子锁扣(Guardmolecular)将DNA聚合酶与抗体紧密结合形成双保险,使其室温条件下失活,只有通过95℃高温2分钟才能开启小分子锁扣,激活DNA聚合酶活性,有效避免了非特异性扩增现象。
  热启动DNA聚合酶技术
  样品分区微反应单元体积大小一致且稳定是泊松分布准确计算的前提。样本反应液在进行液滴分散过程中由于液体表面张力、操作不当等影响,导致其部分发生融合和破裂。融合使液滴体积变大,破裂则导致有效分区数量变少更增加了交叉污染的风险。因此,整个实验过程需严格按照标准流程进行实验操作。相较于液滴式分区,QIAcuity数字PCR搭配的Nanoplate采用纳米微孔设计,利用微流体技术将数字PCR反应体系分配到大小均一且固定微孔中,并在分区完成后自动封闭所有微孔联通管道,真正意义上实现独立均一的微反应体系。
  热循环过程PCR扩增效率的高低直接影响最终信号的判读和实验结果分析。在进行热循环实验时,需检查样品的密封性以及PCR反应板是否和PCR仪热盖完全接触,确保PCR过程中样品反应液没有蒸发。QIAcuity数字PCR系统采用独立的微反应腔室封闭方式,固态的物理分割和封闭可有效避免PCR过程中微反应体系的水分蒸发,确保微反应体系中样本反应液浓度的恒定,更易实现准确和精确的定量。
  数据分析原始数据中往往发现阳性信号与阴性背景之间存在许多弱阳性信号。因此需要对引物探针进行重新设计和优化(详见引物探针优化设计)或提升退火温度(探针通常比引物高5~10℃),以消除疑似荧光信号的“雨区“现象;此外,阳性信号和阴性背景间隙过小,导致最终结果无法准确判读。因此需要调整引物探针浓度(建议总反应体系引物浓度为600~800nM;探针浓度为200-400nM)或5'端前三个碱基如有G出现,则将其互补序列设计为实验所用探针,以提高阴阳性信号间隙,便于分析结果的准确判读。