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数字PCR的运行阶段

更新时间:2022-12-16

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  数字PCR是一种核酸检测和定量的新方法。同传统PCR以及qPCR相比,增加了一步分液的操作,将几十微升的已经配好的包含有引物、模板、buffer、酶等组分的PCR反应体系分隔成了众多微小的、独立的反应体系,这样能够直接数出DNA分子的个数,对起始样品定量,通过将一个样本分成几万到几百万份,分配到不同的反应单元,每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。如下图:
 

数字PCR

 

  PCR 运行可以分为三个阶段:
 
  指数期
 
  每个循环积聚的产物准确加倍(假定 100% 反应效率)。该反应具有高度特异性和准确度。出现指数式扩增,因为所有试剂均新鲜可用,反应的动力学推动反应有利于扩增子加倍。
 
  线性期(高变异性)
 
  随着反应继续,一些试剂因扩增而被消耗。反应开始减缓,并且每个循环的 PCR 产物不再加倍。
 
  平台期(终点:使用传统方法进行凝胶检测)
 
  反应停止,不再产生更多产物,并且如果放置时间够长,PCR 产物将开始降解。因为每个样品具有不同的反应动力学,所以每支试管或每个反应将在不同的时间点进入平台期。在平台期可以看到这些差异。在平台期内,传统 PCR 进行测量,又称为终点检测。
 
  数字PCR检测的是游离DNA,采血管为游离DNA管,采样5-10ml。检测过程包括核酸提取、芯片制备、PCR扩增、芯片阅读、结果分析,实现全程基本自动化、封闭式操作,避免污染。无需培养,节省时间;高灵敏度,提高检出率;多色荧光检测,一管血可检测23个靶标,节省宝贵样本,帮助解决“检出率低”和“检测周期长”两大痛点,达到早期诊断、疗效监测的目的。