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荧光定量PCR技术常用的两种分析方法

发布时间:2021-12-08

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   荧光定量PCR是分子生物学实验手段,也是检验科常用的方法。它通过荧光染料或荧光标记的具有特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,可以实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度,也被称为实时荧光定量pcr。
  它是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。该技术不仅实现了对DNA模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点,目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。在该技术中,有一个很重要的概念是Ct值。C代表Cycle, t代表threshold, Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
  荧光定量pcr常用的两种方法分别为:荧光染料掺入法和探针法
  1、荧光染料掺入法
  荧光染料掺入法原理是:在PCR反应体系中,加入过量荧光染料,荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
  2、探针法
  探针法荧光定量pcr原理是:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成同步。